Реутерин

Научная статья

Спектр ингибирующей активности реутерина, вырабатываемого Lactobacillusreuteri, в отношении кишечной флоры.

Велентайн Клюсик, Кристоф Лакруа, Сабина Волленвейдер, Марк Дюбуаи Гвенелл Ле Блей

Исследовательский институт пищевых продуктов и питания, лаборатория пищевых биотехнологий, Швейцарский Федеральный институт технологий, Цюрих, Швейцария

BMCMicrobiology 2007, 7:101doi:10.1186/1471-2180-7-101

Электронная версия является полной версией статьи и доступна онлайн по адресу: http://www.biomedcentral.com/1471-2180/7/101

© 2007 Cleusix и соавт.; владелец лицензии BioMed Central Ltd.
Это статья открытого доступа, распространяемая на условиях лицензии Creative Commons с указанием авторства (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), которые позволяют неограниченное использование, распространение и воспроизведение любым способом, при условии правильного цитирования оригинальной работы.

Обоснование

Реутерин, вырабатываемый из глицерина Lactobacillusreuteri, представителем нормальной флоры кишечника человека, является противомикробным препаратом широкого спектра действия. Было высказано предположение, что реутерин может играть определенную роль в пробиотическом действии Lb. reuteri. Реутерин активен в отношении патогенной кишечной флоры, дрожжей, грибов, простейших и вирусов, но его влияние на условно-патогенную кишечную флору неизвестно. Более того, до сих пор не ясен механизм действия реутерина. Глутатион, мощный антиоксидант, который также играет ключевую роль в детоксикации реактивных альдегидов, защищает определенные бактерии от окислительного стресса, а также может иметь отношение к устойчивости к реутерину. Целью данной работы была проверка активности реутерина в отношении репрезентативной панели кишечных бактерий и исследование возможной корреляции между внутриклеточными низкомолекулярными тиолами (LMW-SH), такими как глутатион, перекисью водорода и / или чувствительностью реутерина. Реутерин вырабатывался Lb. reuteri SD2112 в растворе чистого глицерина, очищался и использовался для проверки минимальной ингибирующей (МИК) и минимальной бактерицидной концентрации (МБК). Также анализировали чувствительность перекиси водорода и концентрации внутриклеточных LMW-SH.

Результаты

Наши данные показали, что большинство исследуемых кишечных бактерий демонстрировали MИК ниже, чем у чувствительного индикатора Escherichiacoli(7.5–15 ммоль). Лактобактерии и Clostridiumclostridioformeбыли более устойчивыми в диапазоне МИК от 15 до 50 ммоль. Не было выявлено корреляции между бактериальной внутриклеточной концентрацией LMW-SH, в том числе, глутатиона, и чувствительностью к реутерину или перекиси водорода.

Заключение

Наши данные показали, что кишечные бактерии выявили высокую чувствительность к реутерину, и что их внутриклеточная концентрация LMW-SH не связана напрямую с их резистентностью к реутерину или перекиси водорода. Это говорит о том, что детоксикация LMW-SH, такими как глутатион, не является основным механизмом, и, вероятно, другие механизмы участвуют в устойчивости бактерий к реутерину и перекиси водорода.

Lactobacillusreuteriявляется гетероферментативной молочнокислой бактерией, которая принадлежит к аутохтонной микрофлоре человека и животных [1]. Исследования на животных показали, что определенные штаммы Lb. reuteri, используемые в качестве пробиотиков, могут обеспечить защиту от вредного воздействия некоторых микробиологических, химических и физических стресс-факторов, снизить уровень холестерина; модулировать иммунный ответ, а также улучшить развитие ткани подвздошной  кишки[2-4].

Было показано, что Lb. reuteriSD2112 (ATCC 55730) уменьшает заболеваемость и степень тяжести диареи различной этиологии у детей и взрослых [5-7],обеспечивает пассаж по желудку и верхним отделам кишечника и временно колонизирует желудочно-кишечный тракт человека [6]. Действительно, этот штамм более десяти лет использовали в качестве пробиотика и / или закваски в пищевой и медицинской продукции [4].

В присутствии глицерина Lb. reuteri может синтезировать 3-гидроксипропиональдегид (3-HPA). 3-HPA экскретируется в среду, где он образует вместе с гидратом и димером (реутерином), динамическое многокомпонентное равновесие (HPA, HPA-система, называемая в большинстве публикаций реутерином) [4].Реутерин является мощным антимикробным средством, активным в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также дрожжей, плесеней и простейших [8]. Реутерин синтезируется in vitro при рН, температуре и анаэробных условиях, близких к условиям желудочно-кишечного тракта [9]. In vivo, синтез активного реутерина может происходить в толстой кишке в процессе метаболизма Lb. reuteri, при наличии достаточного количества глицерина, который является продуктом микробиологического брожения в просвете кишечника, переваривания жиров в просвете кишечника, отторжения слизи и десквамированных эпителиальных клеток и кишечного клиренса эндогенного глицерина плазмы[2]. По нашим данным, в настоящее время нет данных о количестве доступного глицерина для бактериального преобразования в реутерин в кишечнике человека.

Реутерин является водорастворимым, эффективным в широком диапазоне рН, устойчивым к протеолитическим и липолитическим ферментам и поэтому изучен как пищевой консервант или вспомогательное терапевтическое средство [4,8,10]. Полагают, что реутерин также играет роль в пробиотических эффектах Lb. reuteri SD2112, но его механизм действия на рост микроорганизмов не выяснен из-за крайне сложной химической HPA-системы [4].Было предположено, что реутерин может ингибировать активность бактериальной рибонуклеотидной редуктазы, фермента, катализирующего первый этап синтеза ДНК, путем конкуренции (HPA-димер) с рибонуклеотидами за места связывания или с помощью реакции (3-HPA) с нестабильными сульфгидрильными группами рибонуклеотидной редуктазы или с тиоредоксином, необходимым для ферментативной активности [11].Ингибирование превращения рибонуклеотидов в дезоксирибонуклеотиды могло бы объяснить широкий спектр действия реутерина [11]. Оно также предполагает, что механизм действия реутерина может быть направлен на сульфгидрильные ферменты, и что устойчивость бактерий к реутерину может быть связана с внутриклеточными уровнями LMW-SH таких, как глутатион (неопубликованные данные).

Восстановленный глутатион (GSH), является цистеин-содержащим трипептидом, наиболее часто встречающимся в грамотрицательных бактериях, таких как пурпурные бактерии и сине-зелёные водоросли. Самые высокие концентрации GSH наблюдаются в аэробах или факультативных анаэробах, в то время как облигатные анаэробы, как правило, лишены GSH, но обладают другими растворимыми тиоловыми соединениями[12]. Тем не менее, некоторые факультативные анаэробные грамположительные бактерии (например, Lactococcuslactis, подвид. lactis, StreptococcusagalactiaeАТСС 12927 или EnterococcusfaecalisАТСС 29212) могут синтезировать значительное количество GSH, тогда как другие (например, Lactococcuslactis, подвид. cremorisZ8, или StreptococcusmutansАТСС 33402) могут извлекать GSH из питательной среды, но эта способность является штаммо-зависимой[13,14].GSH выполняет важные функции у бактерий, включая контроль окислительно-восстановительного потенциала, защиты от окислительного стресса, детоксикации эндогенных и экзогенных токсинов, фолдинга и хранения белка, транспортировки органической серы[15]. Полагают также, что этот мощный антиоксидант играет ключевую роль в детоксикации реактивных альдегидов, например, акролеина, и защищает клетки от окислительного повреждения, например, выработанной перекиси водорода [16]. Недавно было показано, что глутатионредуктаза способствует кислородной устойчивости Lactobacillus sanfranciscensis [17]. Различные исследования опубликовали МИК реутерина в отношении патогенных микроорганизмов и молочнокислых бактерий [9,11,18]. Но данные по активности чистого реутерина в отношении кишечных бактерий никогда не публиковались, хотя эти данные важны для понимания пробиотических эффектов Lb. reuteriinvivoпри применении у человека и животных. Поэтому целью данного исследования было определение антибактериальной активности чистого реутерина invitroна репрезентативной панели кишечных бактерий человека. Внутриклеточная концентрация LMW-SH и чувствительность кишечных бактерий к перекиси водорода также регистрировались, чтобы предварительно определить чувствительность реутерина к внутриклеточным LMW-SH, таким как GSH, и переносимость кислорода.

Получение и очистка реутерина

Из 200 ммоль глицерина Lb. reuteriSD2112 вырабатывала170 ммоль реутерина. После очистки 140 мл этого раствора выделяли около 1 г чистого реутерина, что соответствовало выходу 57%. После процесса очистки получили реутерин высокой степени чистоты, без таких примесей как глицерин и 1,3-пропандиол, о чем свидетельствуют данные ВЭЖХ анализа (Рисунок1).

Рисунок 1. ВЭЖХ хроматограммы. a) супернатант до очищения; b) реутерин после очищения на хроматографической колонке 60 с силикагелем с использованием ацетона с этилацетатом в соотношении 2:1 в качестве элюента.

Aнтимикробная активность

МИК и МБК исследуемых бактерий представлены в Таблице 1. Как и предполагалось, самым устойчивым видом оказалась Lb. reuteriс диапазонами МИК и МБК обоих исследуемых штаммов 30–50 ммоль и 60–120 ммоль, соответственно, затем следуют другие лактобактерии (диапазон МИК 15–40 ммоль; диапазон МБК 15–80 ммоль). МИК и МБК чувствительных штаммов Escherichiacoliнаходились в диапазоне от 7 дo 15 ммоль и от 15 дo 30 ммоль, соответственно.

Taблица 1.

Среди 19 (не лактобактерий) исследуемых видов, 15 продемонстрировали значения МИК ниже, чем определенные для индикаторного штамма E. coliсМИК, равной или ниже 7,5 ммоль. Наиболее чувствительными штаммами к реутерину были Bacteroidesvulgatusи Clostridiumdifficile(МИК< 1.9 ммоль), за которыми следуют Bacteroidesthetaiotaomicron, Eubacteriumeligens, Bifidobacteriuмлongumvarinfantis, Eubacteriumbiforme, Bifidobacteriumlongumи Bifidobacteriumcatenulatum(диапазон МИК от 1,9 дo 3,8 ммоль). Четырьмя самыми устойчивыми видами (не лактобактерий) были Clostridiumclostridioforme(показатели МИК 15–30 ммоль; МБК 15–30 ммоль) а также Ruminococcusproductus, Bifidobacteriumbreveи Listeriainnocua(показатель МИК 7,5–15 ммоль и показатель МБК 3,8–15 ммоль).

Внутриклеточная концентрация LMW-SH, включая глутатион (GSH)

Внутриклеточные концентрации LMW-SH в исследуемых бактериях представлены в Таблице 1. LMW-SH определяли для всех бактерий, они находились у большинства бактерий в диапазоне от 1,3 дo 3,1 мкмоль/10¹²  колониеобразующих единиц [КОЕ]. Самые высокие концентрации обнаружили у Cl. difficile(43 мкмоль/10¹² КОЕ) а также у Collinsellaaerofaciens, Lactobacillussalivarius, Lactobacillusacidophilusи Streptococcussalivarius(диапазон от 22 до 10 мкмоль/10¹² КОЕ). E. coli, Bacteroidesfragilis, Lb. reuteri(DSM 20016 и SD 2112), L. innocua, B. longumvarinfantisи Enterococcusfaeciumбыли выявлены промежуточные значения в диапазоне от 8 дo 5 мкмоль/10¹² КОЕ).

Чувствительность к перекиси водорода

Чувствительность некоторых кишечных бактерий к перекиси водорода представлена в Таблице 2. У всех исследуемых бактерий за исключениемE. faecium, воздействие 10, 20 and 30 г л^-1 перекиси водорода вызывало снижение количества жизнеспособных клеток по сравнению с контрольной средой без перекиси водорода. Среди всех исследованных 4 наиболее устойчивыми видами были E. faecium, Lb. acidophilus, Lb. reuteri(DSM 20016) и S. salivariusс коэффициентами выживаемости при воздействии 30 г л^-1 перекиси водорода от 75,6 до 0,06%. У второй группы, B. longumvarinfantisи Lactobacillusfermentumвыживаемость при воздействии 20 г л^-1 перекиси водорода (составляла 0,18 и 0,02 %, соответственно), тогда как в третьей группе, в которую входят четыре вида бифидобактерий и три вида лактобактерий, при воздействии  10 г л^-1 перекиси водорода был получен коэффициент выживаемости от 0,07 до 24,9 %. Группа с максимальной чувствительностью с полным ингибированием роста при воздействии 10 г л^-1 перекиси водорода включала 9 видов, относящихся к роду облигатных анаэробов кишечника человека (Bacteroidesspp., Clostridiumspp., C. aerofaciens, E. biforme, R. Productusи один вид бифидобактерий из 6 исследованных). Неожиданно, классифицируемые как факультативные анаэробы, Listeriaspp.и E. coli, также полностью ингибировались 10 г л^-1 перекиси водорода.

Taблица 2.

В данном исследовании определяли МИК и МБК чистого реутерина различных кишечных бактерий с использованием количественного анализа на титрационных микропланшетах. За исключением Dobrogosz и соавт. [19], которые выражали ингибирующую активность реутерина в определенных условных единицах, после исследования меченным ¹⁴C глицерином, как 1 ЕД эквивалентную 8 мкг реутерина/мл, большая часть исследователей использовала недостаточно определенные условные единицы для выражения ингибирующей концентрации реутерина [10,20]. По этой причине сложно провести прямое сравнение опубликованных данных относительно антимикробной активности реутерина в отношении различных микроорганизмов. Другой проблемой данных исследований является то, что молярную концентрацию реутерина рассчитывали с использованием молекулярной массы димера [9,11,21,22], несмотря на то, что при использовании низких концентраций реутерин встречается и в форме мономера [4]. Кроме того, как это было показано у бактериоцинов, условные единицы изменяются под влиянием различных экспериментальных факторов, таких как изменение чувствительности индикаторных штаммов одинаковых видов, состояние сред и условий инкубации при определении активности и концентрации антимикробных соединений в исследуемых препаратах [23,24]. Для сравнения данных условия тестов должны быть стандартизованы, а показатели МИК представлены в мкг мл^-1 или ммоль. В этом исследовании молярную концентрацию реутерина определяли с помощью метода, разработанного первоначально для количественного определения акролеина, используя катализируемый кислотой образование окрашенного комплекса между акролеином/гидроксипропаналом и триптофаном[25], который применяется другими авторами для количественного определения реутерина[4,26-28]. Кроме того, исследования бактерий проводили в контролируемых условиях с использованием той же среды для определения активности.

Наши данные показывают, что реутерин является эффективным ингибитором большинства исследуемых кишечных микроорганизмов, за исключением лактобактерий. Из 20 видов, не относящихся к роду Lactobacillus, 14 ингибировались и/или гибли под влиянием реутерина в концентрациях равных или ниже 3,8 ммоль. Ими была проявлена более высокая чувствительность, чем у E. coli, обычного чувствительного индикатора, используемого при анализе реутерина[4]. Dobrogosz и соавт.[11] и Chung и соавт. [9] сообщили, при использовании теста двукратных разведений, МИК для E. coliK12 составляла 4–5 Ед/мл (0,9–1,1 ммоль, после пересчета на мономер 3-гидроксипропанала и 1 ЕД = 8 мкг реутерина/мл), 32 ЕД/мл (6,9 ммоль) для Lb. reuteriи показатели от 4 дo 42 ЕД/мл (0,9–9,1 ммоль) для разных видов лактобактерий. Наши данные продемонстрировали такие же тенденции; показатели МИК для лактобактерий были, как минимум, в 2 раза выше, чем для E. coli(Taблица1). Однако в наших условиях исследования, МИК, измеренная для лактобактерий, была приблизительно в 10 раз выше, чем сообщали в предыдущих исследованиях. Dobrogosz и соавт. [11] обнаружили, что Listeriamonocytogenesдемонстрировала сходную с лактобактериями низкую чувствительность к реутерину, с МИК, равной 4–42 ЕД/мл (0,9–9,1 ммоль), которая отличалась от наших данных для L. ivanoviiи L. innocua, которые были намного более чувствительными к реутерину, чем лактобактерии. Эти различия МИК, полученные в различных исследованиях, могут быть результатом различных факторов произвольных исследований активности, включая pH, питательную среду, температуру инкубации, концентрацию и физиологическое состояние исследуемой бактерии, которые оказывают влияние на рост [23] исследуемых штаммов и активность реутерина [27]. Кроме того, в нашем исследовании использовали строгие критерии расчета МИК (минимальной концентрации реутерина, вызывающей полное ингибирование исследуемого штамма). Действием альдегида 3-гидроксипропанала является высокая реактивность из-за присутствия в его составе β-гидроксильной группы, вследствие чего молекула спонтанно вступает в реакцию с имеющимися в структуре питательных сред и бактерий амино- и сульфгидрильными функциональными группами [4]. Согласно данным Lüthi-Peng и соавт. [27], только 30 % реутерина остается свободным после 24 часов инкубации при температуре 37°C в многокомпонентной питательной среде. Лактобактерии также исследовали в питательной среде LAMVAB[29], которую используют как селективную среду для подсчета лактобактерий в образцах кала при pH 5,0. В этой среде МИК были в 2–5 раз ниже, чем МИК, полученные на среде с добавлением сердечно-мозговой вытяжки (BHI) (данные не представлены). Данный результат ясно показывает, сложности при сравнении данных, полученных из различных исследований активности реутерина, намного более достоверными являются сравнения, проводимые в пределах одного исследования. Это ограничение следует также принимать во внимание, когда данные о чувствительности к антимикробным препаратам, таким как реутерин, получаемые в тестах invitro, экстраполируют на другие системы invitroили условия invivo, такие как в желудочно-кишечном тракте. Для предположительного объяснения различных свойств кишечных бактерий в отношении активности реутерина, мы исследовали их внутриклеточную концентрацию LMW-SH в том числе, глутатиона, который, как было показано, участвует в механизмах детоксикации альдегидов[30]. Для этой цели мы использовали реактив Элмана, который специфически реагирует с тиоловыми группами. Для того, чтобы отличить LMW-SH, и тиоловые группы белков, концентрацию внутриклеточных LMW-SH определяли в бесклеточном супернатанте суммарного экстракта бактерий, после элиминации белков с помощью преципитации сульфосалициловой кислотой. Хотя в настоящем исследовании измеряли содержание, не только глутатиона, а всех LMW-SH, этот тест позволяет надежно оценить концентрацию глутатиона, поскольку другие LMW-SH встречаются только в низкой концентрации[31]. LMW-SH имелись во всех исследованных бактериях. Максимальные внутриклеточные концентрации (> 20 мкмоль/10¹² клеток) отмечались у двух видов грамположительных облигатных анаэробов (C. aerofaciensи Cl. difficile) и одного вида факультативного анаэроба (Lb. salivarius). Хотя, как представляется, глутатион, главным образом присутствуют в сине-зеленых водорослях и пурпурных бактериях[12], Высокая внутриклеточная концентрация глутатиона уже была отмечена у грамположителных клостридий, в том числе, у облигатных анаэробов, таких как Clostridiumperfringens[32] и Lactobacillusspp.[33,34] и Bifidobacteriumspp.[35]. Обычно считают, что грамположительные микроорганизмы  не вырабатывают глутатион, а аккумулируют его из питательной среды. Однако другие данные указывают, что некоторые грамположительные бактерии (например, EnterococcusfaecalisATCC 29212 или StreptococcusagalactiaeATCC 12927) могут синтезировать глутатион [13]. Более того, Fernandes и Steele [33] показали, что внутриклеточные уровни глутатиона молочнокислых бактерий широко варьируют у микроорганизмов и, в значительной степени, зависят от исследуемых штаммов, а также условий роста, в том числе, состава питательной среды (наличие или отсутствие глутатиона  или его предшественников) и аэрации, а также фазы бактериального роста. Имеется малое количество сообщений о способности кишечных бактерий синтезировать глутатион или получать его из питательной среды. Было показано, что некоторые штаммы пробиотических лактобактерий могут вырабатывать и даже выделять большое количество глутатиона[36]. В нашем исследовании питательная среда была без цистеина, который является главным предшественником синтеза GSH. Однако GSH из дрожжевого экстракта, вероятно, был более доступен для усваивания бактериями в питательной среде [12]. По нашим недавним наблюдениям добавление GSH может нейтрализовать токсичность реутерина (3-HPA) в отношении E.coli K12, что предполагает корреляцию между индуцированной токсичностью 3-HPA в отношении E.coli K12 и истощения GSH (неопубликованные данные). Тем не менее, в этом исследовании, отсутствие корреляции между внутриклеточными концентрациями GSH и чувствительностью реутерина показывает, что другие механизмы детоксикации предотвращают токсичность 3-HPA, такие как 1,3-пропандиол-дегидрогеназа, которая преобразует 3-HPA в неактивный 1,3 – пропандиол. До настоящего времени нет данных относительно ингибирующей активности 1,3-пропандиола в отношении кишечных бактерий.

Считается, что GSH играет ключевую роль в защите клеток от окислительного стресса. В E.coli он является, как правило, наиболее распространенным внутриклеточным тиолом с низким молекулярным весом [32] и может способствовать защите клеток E.coli [30], а также грамположительных бактерий [34] от смертельного действия окислительного повреждения. Известно, что GSH может уменьшить количество перекиси водорода в обмене для окисления GSH в дисульфид глутатиона (GSSG) [30]. Устойчивость кишечных бактерий к перекиси водорода определяли для оценки возможной корреляции между их чувствительностью к реутерину и детоксикацией кислородом. Считается, что токсичность кислорода является результатом действия активированных соединений, включая супероксид, перекись водорода и гидроксильные радикалы [37].Факультативные анаэробные бактерии ферментативно разлагают и нейтрализуют эти активированные кислородом метаболиты с помощью супероксиддисмутазы и каталазы [37]. Большинство кишечных бактерий классифицируют как строгие анаэробные микроорганизмы, лишенные этих ферментов, поэтому присутствие H₂O₂ может ингибировать их рост[37].

Действительно, большинство исследованных чувствительных к кислороду видов, принадлежащих к группам Bacteroidales(Bacteroidesspp.) и Clostridiales (Clostridiumspp., Ruминococcussp., Eubacteriumspp. и Collinsellasp.) полностью ингибировались при 10 г л^-1 перекиси водорода. Пять бифидобактерий из шести исследованных не ингибировались 10 г л^-1 перекисью водорода, хотя их классифицируют как строгие анаэробные бактерии. Используя ту же технику, Shimamura и др.[37] сообщили о различиях чувствительности к H₂O₂  Bifidobacteriumspp., и получили аналогичные результаты с B. infantis, которая наименее чувствительна к H₂O₂, затем следуют B. breve, B. adolescentisи B. longum. Оказалось, что исследованные факультативные анаэробные бактерии в значительной степени отличаются по их чувствительности к перекиси водорода. Среди лактобактерий Lb. acidophilusи Lb. reuteriDSM 20016 были наиболее устойчивыми. Lb. acidophilus и Bifidobacteriumspp. имеют НАДН (никотинамидадениндинуклеотид) оксидазу и НАДН пероксидазу для удаления отработанной перекиси водорода и предотвращения гибели клеток в присутствии кислорода [37,38]. Кроме того, известно, что некоторые штаммы Lb. acidophilusвырабатывают перекись водорода и пероксидазу [39]. В дополнение, отдельные лактобактерии продуцируют супероксиддисмутазу[40] и негемовую псевдокаталазу[41].

Неожиданно то, что E. coliи Listeriaspp., также классифицируемые как факультативные анаэробы и которые имеют в составе каталазу, ингибировались 10 г л^-1 перекиси водорода. Но также было показано, что высокая чувствительность к H₂O₂ E. coliбыла связана с повреждением ДНК, вызываемым перекисью водорода [42]. В этом исследовании мы не установили какую-либо корреляцию между бактериальной чувствительностью к перекиси водорода и внутриклеточной концентрацией LMW-SH или чувствительностью к реутерину. Тем не менее, широкий спектр исследуемых микроорганизмов и разнообразие механизмов кислородной детоксикации, а также широта функций LMW-SH и GSH микроорганизмов [15] предполагают вероятность вовлечения штамм-специфичных механизмов, а не основного механизма, типичного для всех бактерий.

Впервые данное исследование показало антимикробную активность реутерина в отношении различных кишечных бактерий. Наблюдались большие различия между видами. Кроме штаммов Lactobacillus, которые были более устойчивыми, большая часть кишечной флоры ингибировалось реутерином в концентрации ниже 7,5 ммоль. Более того, МБК (7,5–15 ммоль), отмеченная у двух протестированных Listeriaspp, была выше, чем у основных кишечных симбионтов. Большинство чувствительных видов ингибировались концентрацией реутерина около 2 ммоль, что предполагает, что низкие концентрации выработки реутерина insitu(при наличии достаточного количества посредством выработки insituили после принятой внутрь капсулированной формы пробиотических бактерий) представляются достаточными для изменения роста кишечных бактерий. Однако эти результаты, полученные в исследованиях активности invitro, следует применять с осторожностью при экстраполяции на специфические условия invivo, где другие важные факторы, такие как конкуренция за нутриенты и антагонистические и/или синергетические связи между кишечной микробиотой могут в большой степени повлиять на ингибирующие эффекты антимикробных средств, таких как реутерин. Поэтому необходимы дополнительные эксперименты в более сложных invitro системах, таких как invitroмоделях кишечной ферментации, так как эксперименты invivoочень сложны. Не существует корреляции между бактериальной чувствительностью к реутерину и внутриклеточной LMW-SH и/или чувствительностью к перекиси водорода. Наши данные предполагают, что защита посредством LMW-SH таких, как GSH, не является основным защитным механизмом в отношении токсичности реутерина.

Химические вещества

Если не указано другое, все химические вещества были получены от Fluka, Buchs, Швейцария.

Штаммы бактерий, питательные среды и условия роста

Бактерии, использованные в исследовании, представлены в Таблице 1. Все штаммы хранили в замороженном состоянии при температуре -80°C в 25 % (об./об.) глицерине с добавлением L-цистеина (0,05 %). Перед использованием кишечные бактерии пересевали, как минимум, дважды с 24-часовыми интервалами в среде с сердечно-мозговой вытяжкой (BHI, Biolife, Милан, Италия) с добавлением дрожжевого экстракта (5 г/л), K₂HPO₄ (1 г/л), глюкозы (8 г/л), твина 80 (1 мл/л), гемина (0.005 г/л), витамина K1 (0.002 г/л) и цитрата титана (0.6 ммоль) в качестве восстановительного средства, при температуре 37°C (pH 6.6) в газовой среде N₂ и CO₂ (1,5 бар, 80:20 [объем/объем]). Исследуемые бактерии инкубировали 14 -18 часов при температуре 37°C. Lb. reuteriSD2112 (ATCC 55730), используемую для выработки реутерина [27], выращивали при температуре 37°C в MRS бульоне [43] от Difco Laboratories (Милан, Италия).

Выработка реутерина

Реутерин получали, как было описано выше Vollenweider и соавт. [44]. Коротко, Lb. reuteriинокулировали в 1% (об./об.) 10 мл MRS бульон, инкубировали в течение ночи при температуре 37°C и добавляли в 50 мл MRS среду, которую затем инкубировали в течение 3 часов при температуре 37°C. Эту культуру добавляли к 1 л MRS среды с добавлением 20 ммоль глицерина и инкубировали в течение ночи. Затем клетки собирали центрифугированием при 1500 × gв течение10 мин при температуре 20°C, промывали калий-фосфатным буфером (0,1 M, pH 7.0), ресуспендировали в 300 мл стерильного водного раствора глицерина (200 ммоль) и инкубировали в течение 2 часов при температуре 37°C. Клетки удаляли центрифугированием (8000 × g, 10 мин), и 140 мл надосадочной жидкости стерилизовали путем фильтрации (FP/30/0.2 CA-S; Schleicher & Schuell GmbH, Einbeck, Germany) и лиофилизировали. Реутерин очищали в хроматографической колонке 60 с силикагелем (Merck, Дармштадт, Германия), с ацетоном: этилацетатом (2:1) в качестве элюента. 3-HPA раствор разбавляли водой до получения 10 M раствора, который был стабильным, как минимум, в течение 6 месяцев при температуре 4°C. Концентрация и чистота 3-HPA контролировалась колориметрическим методом и ВЭЖХ анализом как описано ниже.

Количественное определение 3-HPA

Концентрацию в исследуемом растворе определяли с помощью количественного анализа для определения содержания 3-HPA, основанного на колориметрическом методе Circle и соавт. [25], использующего акроилеин для калибровки, как описано Vollenweider и соавт. [44]. Раствор 3-HPA анализировали с помощью ВЭЖХ (Hitachi LaChrome, Merck, Dietikon, Швейцария) на колонке Aminex HPX-87H (300 × 7.8 мм, Bio Rad, Reinach, Швейцария) с 10 ммоль H₂SO₄ в качестве элюента и скоростью потока 0.6 мл мин^-1 [45].

Антимикробная активность

Минимальная ингибирующая (MIC) и бактерицидная (МБК) концентрации 3-HPA определяли с помощью количественного анализа микротитрования, основанного на методе, описанном Mota-Meira и соавт. [46] с модификациями. Все манипуляции проводились в анаэробной камере в атмосфере, содержащей азот с содержанием 5 % (об./об.) водорода. Коротко, бактерии выращивали в анаэробных условиях с добавлением BHI при температуре 37°C в течение 15-18 часов. Оптическая плотность (OD_{590 нм}) корригировалась до 0,1 с помощью нового добавления BHI среды, используя спектрофотометр (1420 Multilabel Counter, Wallac, PerkinElmer, Schwerzenbach, Швейцария). Такая OD_{590 нм} примерно соответствует 0,5 McFarland стандарту (Национальный комитет по клиническим лабораторным стандартам, 1991). Перед каждым исследованием из маточного раствора (10 M) готовили рабочий раствор реутерина (300 ммоль, с добавлением сердечно-мозгового экстракта). Сто микролитров рабочего раствора реутерина добавляли в первый ряд 96-луночных планшет (планшеты для тканевых культур, плоскодонные, Greiner Bio-one, St-Gallen, Швейцария), содержащих 100 мкл бульона с добавлением с добавлением сердечно-мозгового экстракта и выполнялась последовательное двукратное разбавление. Реутерин не добавляли в последнюю лунку колонки, которую использовали в качестве положительного контроля роста. В каждую лунку затем инокулировали 25 мкл OD-стандартизированной бактериальной суспензии. Планшеты для титрования инкубировали в анаэробных банках с системой генерации атмосферы (OxoidAnaeroGenTM, Oxoid, Bâle, Швейцария) при температуре 37°C в статических условиях до получения положительного контроля роста (исследуемые бактерии, выросшие без реутерина) показали явный бактериальный рост (OD_{590 нм} ≥ 0.8). После инкубации измеряли OD_{590 нм} с помощью микропланшет-ридера. Планшеты без инокуляции в бульон с добавлением сердечно-мозгового экстракта и ингибитором, инкубировали при тех же условиях, использовали в качестве контроля. E. coliK12 использовали в качестве индикаторного микроорганизм из-за его высокой чувствительности к реутерину[11]. МИК рассчитывали по самому высокому разведению, демонстрирующего полное ингибирование исследуемого штамма (OD_{590 нм} равноOD_{590 нм} контроля). МБК, соответствующей концентрации, убивающей 99,9 % первоначально введенного инокулята [47], определяли с помощью нанесения капель 20 мкл из ряда разведения, выполненного с образцами из первой лунки, не показывающей видимый рост в агаре с добавлением сердечно-мозгового экстракта. МБК определяли как минимальную концентрацию, при которой не наблюдалось роста на планшете с агаром [47]. Планшеты с агаром инкубировали в банках в анаэробных условиях в течение 48 часов. МБК реутерина выражали в ммоль. Каждый микроорганизм исследовали от 3 до 15 раз отдельно, и результаты представляли в виде диапазона МИК или МБК, выраженного в ммоль.

Определение LMW-SH, в том числе, GSH

Внутриклеточное содержание LMW-SH-групп определяли в депротеинизированных бесклеточных экстрактах бактериальных культур с помощью колориметрического метода Элмана[48], с некоторыми модификациями. Бактерии инокулировали в 1% (об./об.) бульон с добавлением сердечно-мозгового экстракта и инкубировали в течение ночи в герметически закрытых в газовой среде N₂ и CO₂ (1.5 бар, 80:20 [об./об.]) при температуре 37°C. Число бактериальных клеток определяли путем культивирования на агар с добавлением сердечно-мозгового экстракта. Пятнадцать мл бактериальной культуры центрифугировали при 3000 × gв течение 10 мин и гранулы тщательно ресуспендировали в 300 мкл раствора B-PER™( Реактив экстракта бактериальных белков). Объем 130 мкл этого раствора смешивали с 130 мкл 5-SSA (2.5 % вес/об.). Смесь инкубировали в течение 15 мин при температуре 4°C и осажденные белки удаляли путем центрифугирования (10000 × gв течение 15 мин при температуре 4°C). Объем 150 мкл полученной надосадочной жидкости смешивали с 840 мкл калийным буфером (0.2 M, pH 7.5) и 10 мкл реактива Элмана и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Спектр поглощения измеряли при длине волны 412 нм (Uvikon 922, Kontron Instrument, Милан, Италия). Концентрацию представляли в виде мкмоль LMW-SH-группы на 10¹² общее количество бактериальных клеток. Стандартная кривая выполнена с различными концентрациями (0, 20, 40, 60, 80 мкмоль) глютатиона в калий-фосфатном буфере (0,2 M, pH 7.5), который добавляли к 75 мкл/мл раствора B-PER™ (Реактив экстракта бактериальных белков, Pierce Chemical Company, Рокфорд, штат Иллинойс, США) и такого же количества 5-сульфосалициловой кислоты дигидрата (2.5 % вес/об., 5-SSA) для определения GSH, с получением конечного объема 1 мл. После тщательного смешивания добавляли 10 мкл реактива Элмана (100,9 ммоль 5,5′-дитио-бис(2-нитробензойной кислоты) (DTNB) в диметилсульфоксиде) и смесь инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Спектр поглощения измеряли при длине волны 412 нм. Представленные данные являются средними значениями трехкратно выполненных анализов.

Устойчивость к перекиси водорода

Выживаемость клеток в перекиси водорода определяли, как описано ранее Doleyres и соавт. [49] с некоторыми модификациями. Коротко, 100 мкл культуры исследуемых бактерий, инкубированной в течение ночи, добавляли в 900 мкл раствора H₂O₂ в различных конечных концентрациях (0, 10, 20 or 30 г л^-1), и инкубировали в течение 1 мин при температуре 37°C. После инкубации 10 мкл исследуемого образца добавляли к 490 мкл раствора каталазы(168640 МЕ/мл) для остановки реакции. Выживаемость клеток определяли культивированием соответствующего разведения на агаре с сердечно-мозговым экстрактом и инкубировали 48 часов при температуре 37°C. Все манипуляции выполняли в анаэробной камере (Coy Laboratories, Ann Arbor, MI, США) в атмосфере азота, содержащей 5 % (об./об.) водорода. Представленные данные и стандартные отклонения рассчитаны из данных трехкратно выполненных анализов.

Статистика

Данные для теста выживания в перекиси водорода не удовлетворяли предположениям ANOVA (нормально распределенные и независимые остатки) и поэтому их преобразовывали перед анализом. Показатели выживаемости после обработки 10 и 30 г л^-1 H₂O₂ изменялись логарифмической функции log₁₀ после добавления 1. Показатели выживаемости после обработки 20 г л^-1 H₂O₂ делились на 10 и изменялись логарифмической функцией log₁₀. Средние значения обработки сравнивали с помощью теста Тьюки при уровне вероятности P< 0.05. Корреляцию Пирсона рассчитывали между активностью реутерина, устойчивостью к H₂O₂, и концентрациями LMW-SH в бактериальных клетках, используя SPSS 13.0 для Windows (SPSS Inc., Чикаго, штат Иллинойс, США).

Г.Ле Блей, К.Лакруа и В.Клюсик разрабатывали дизайн экспериментов. С.Волленвейдер производила и очищала реутерин. В.Клюсик и M.Дюбуа осуществляли работы по экспериментам исследования активности. В.Клюсик определяла LMW-SH и выживаемость клеток в перекиси водорода. Г.Ле Блей, К.Лакруа и С.Волленвейдер пересматривали рукописи. Все авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи.

Исследование было поддержано грантом ETH (номер TH-21/02–04).

1. Walter J, Heng NC, Haммольes WP, Loach DM, Tannock GW, Hertel C: Identification of Lactobacillus reuteri genes specifically induced in the mouse gastrointestinal tract.Appl Environ Microbiol 2003, 69(4):2044-2051. PubMed Abstract | Publisher Full Text | PubMed Central Full Text
2. Casas IA, Dobrogosz WJ: Validation of probiotic concept: Lactobacillus reuteri confers broad-spectrum protection against disease in humans and animals.MicrobEcol Health Dis 2000, 12:247-285.
3. Mukai T, Asasaka T, Sato E, Mori K, Matsumoto M, Ohori H: Inhibition of binding of Helicobacter pylori to the glycolipid receptors by probiotic Lactobacillus reuteri. FEMS Iммольunol Med Microbiol 2002, 32(2):105-110. PubMed Abstract | Publisher Full Text
4. Vollenweider S, Lacroix C: 3-hydroxypropionaldehyde: applications and perspectives of biotechnological production.ApplMicrobiolBiotechnol 2004, 64(1):16-27. PubMed Abstract | Publisher Full Text
5. Shornikova AV, Casas IA, Isolauri E, Mykkanen H, Vesikari T: Lactobacillus reuteri as a therapeutic agent in acute diarrhea in young children.J PediatrGastroenterolNutr 1997, 24(4):399-404. PubMed Abstract | Publisher Full Text
6. Valeur N, Engel P, Carbajal N, Connolly E, Ladefoged K: Colonization and iммольunomodulation by Lactobacillus reuteri ATCC 55730 in the human gastrointestinal tract.Appl Environ Microbiol 2004, 70(2):1176-1181. PubMed Abstract | Publisher Full Text | PubMed Central Full Text
7. Weizman Z, Asli G, Alsheikh A: Effect of a probiotic infant formula on infections in child care centers: comparison of two probiotic agents.Pediatrics 2005, 115(1):5-9. PubMed Abstract | Publisher Full Text
8. Axelsson LT, Chung TC, Dobrogosz WJ, Lindgren SE: Production of a broad spectrum antimicrobial substance by Lactobacillus reuteri.MicrobEcol Health Dis 1989, 2:131-136.
9. Chung TC, Axelsson L, Lindgren SE, Dobrogosz WJ: In vitro studies on Реутерин synthesis by Lactobacillus reuteri.MicrobEcol Health Dis 1989, 2:137-144.
10. El-Ziney MG, van den Tempel T, Debevere J, Jakobsen M: Application of Реутерин produced by Lactobacillus reuteri 12002 for meat decontaминation and preservation.J Food Prot 1999, 62(3):257-261. PubMed Abstract
11. Dobrogosz WJ, Casas IA, Pagano GA, Talarico TL, Sjöberg BM, Karlson M: Lactobacillus reuteri and the enteric microbiota. In The regulatory and protective role of the normal microflora. Edited by Grubb R, Midtvedt T, Norm E. London , Macmillan; 1989:283-292.
12. Fahey RC, Brown WC, Adams WB, Worsham MB: Occurrence of глютатион in bacteria. J Bacteriol 1978, 133(3):1126-1129. PubMed Abstract | Publisher Full Text
13. Sherrill C, Fahey RC: Import and metabolism of глютатион by Streptococcus mutans.J Bacteriol 1998, 180(6):1454-1459. PubMed Abstract | Publisher Full Text | PubMed Central Full Text
14. Wiederholt KM, Steele JL: Глютатион accumulation in Lactococci.J Dairy Sci 1994, 77(5):1183-1188.
15. Penninckx MJ, Elskens MT: Metabolism and functions of глютатион in micro-organisms.AdvMicrobPhysiol 1993, 34:239-301. PubMed Abstract
16. Smirnova GV, Oktyabrsky ON: Глютатион in bacteria.Biochemistry (Mosc) 2005, 70(11):1199-1211. PubMed Abstract | Publisher Full Text
17. Jansch A, Korakli M, Vogel RF, Ganzle MG: Глютатион reductase from Lactobacillus sanfranciscensis DSM20451T: Contribution to oxygen tolerance and thiol-exchange reactions in wheat sourdoughs.Appl Environ Microbiol 2007. PubMed Abstract | Publisher Full Text | PubMed Central Full Text
18. Chen CN, Sung HW, Liang HF, Chang WH: Feasibility study using a natural compound (Реутерин) produced by Lactobacillus reuteri in sterilizing and crosslinking biological tissues.J Biomed Mater Res 2002, 61(3):360-369. PubMed Abstract | Publisher Full Text
19. Dobrogosz WJ, Lindgren SE: Метода for deterминing the presence of an antibiotic produced by Lactobacillus reuteri. In USPTO Patent full-text and image database. United States ,Biogaia AB; 1994.
20. Rasch M: The influence of temperature, salt and pH on the inhibitory effect of Реутерин on Escherichia coli.Int J Food Microbiol 2002, 72(3):225-231. PubMed Abstract | Publisher Full Text
21. Yuнмbam MK, Roberts JF: The in vitro efficacy of Реутерин on the culture and bloodstream forms of Trypanosomabruceibrucei.CompBiochemPhysiol C 1992, 101(2):235-238. PubMed Abstract | Publisher Full Text
22. Daeschel MA: Antimicrobial substances from lactic acid bacteria for use as food preservatives.FoodTechnology 1989, 43(1):164-166.
23. Turcotte C, Lacroix C, Kheadr E, Grignon L, Fliss I: A rapid turbidometricmicroplate bioassay for accurate quantification of lactic acid bacteria bacteriocins.Int J Food Microbiol 2004, 90(3):283-293. PubMed Abstract | Publisher Full Text
24. Meghrous J, Lacroix C, Simard RE: The effects on vegetative cells and spores of three bacteriocins from lactic acid bacteria. Food Microbiol 1999, 16:105-114. Publisher Full Text
25. Circle SJ, Stone L, Boruff CS: Acrolein deterминation by means of tryptophane. A колориметрическогоmicroметода.IndEngChem Anal Ed 1945, 17(4):259-262. Publisher Full Text
26. Barbirato F, Grivet JP, Soucaille P, Bories A: 3-Hydroxypropionaldehyde, an inhibitory metabolite of glycerol fermentation to 1,3-propanediol by enterobacterial species.Appl Environ Microbiol 1996, 62(4):1448-1451. PubMed Abstract | Publisher Full Text | PubMed Central Full Text
27. Luthi-Peng Q, Scharer S, Puhan Z: Production and stability of 3-hydroxypropionaldehyde in Lactobacillus reuteri.ApplMicrobiolBiotechnol 2002, 60(1-2):73-80. PubMed Abstract | Publisher Full Text
28. Sauvageot N, Gouffi K, Laplace JM, Auffray Y: Glycerol metabolism in Lactobacillus collinoides: production of 3-hydroxypropionaldehyde, a precursor of acrolein.Int J Food Microbiol 2000, 55(1-3):167-170. PubMed Abstract | Publisher Full Text
29. Harteминk R, Domenech VR, Rombouts FM: LAMVAB – A new selective medium for the isolation of lactobacilli from faeces.J Microbiol Meth 1997, 29(2):77-84. Publisher Full Text
30. Nunoshiba T, Yamamoto K: Role of глютатион on acrolein-induced cytotoxicity and mutagenicity in Escherichia coli.Mutat Res 1999, 442(1):1-8. PubMed Abstract | Publisher Full Text
31. Fahey RC: Novel thiols of prokaryotes.Annu Rev Microbiol 2001, 55:333-356. PubMed Abstract | Publisher Full Text
32. Newton GL, Arnold K, Price MS, Sherrill C, Delcardayre SB, Aharonowitz Y, Cohen G, Davies J, Fahey RC, Davis C: Distribution of thiols in microorganisms: mycothiol is a major thiol in most actinomycetes.J Bacteriol 1996, 178(7):1990-1995. PubMed Abstract | Publisher Full Text | PubMed Central Full Text
33. Fernandes L, Steele JL: Глютатион content of lactic acid bacteria.J Dairy Sci 1993, 76(5):1233-1242.
34. Turner MS, Woodberry T, Hafner LM, Giffard PM: The bspA locus of Lactobacillus fermentum BR11 encodes an L-cystine uptake system.J Bacteriol 1999, 181(7):2192-2198. PubMed Abstract | Publisher Full Text | PubMed Central Full Text
35. Musenga A, Mandrioli R, Bonifazi P, Kenndler E, Pompei A, Raggi MA: Sensitive and selective deterминation of глютатион in probiotic bacteria by capillary electrophoresis-laser induced fluorescence.Anal BioanalChem 2007, 387(3):917-924. PubMed Abstract | Publisher Full Text
36. Peran L, Camuesco D, Comalada M, Nieto A, Concha A, Adrio JL, Olivares M, Xaus J, Zarzuelo A, Galvez J: Lactobacillus fermentum, a probiotic capable to release глютатион, prevents colonic inflaммольation in the TNBS model of rat colitis.Int J Colorect Dis 2006, 21(8):737-746. Publisher Full Text
37. Shimamura S, Abe F, Ishibashi N, Miyakawa H, Yaeshima T, Araya T, Tomita M: Relationship between oxygen sensitivity and oxygen metabolism of Bifidobacterium species.J Dairy Sci 1992, 75(12):3296-3306. PubMed Abstract | Publisher Full Text
38. Talwalkar A, Kailasapathy K: Metabolic and biochemical responses of probiotic bacteria to oxygen.J Dairy Sci 2003, 86(8):2537-2546. PubMed Abstract | Publisher Full Text
39. Collins EB, Aramaki K: Production of hydrogen peroxide by Lactobacillus acidophilus.J Dairy Sci 1980, 63(3):353-357. PubMed Abstract | Publisher Full Text
40. Gonzalez SN, Apella MC, Romero N, Pesce de Ruiz Holgado AA, Oliver G: Superoxide dismutase activity in some strains of lactobacilli: induction by manganese.Chem Pharm Bull (Tokyo) 1989, 37(11):3026-3028. PubMed Abstract
41. Holzapfel WH, Haberer P, Geisen R, Bjorkroth J, Schillinger U: Taxonomy and important features of probiotic microorganisms in food and nutrition.Am J ClinNutr 2001, 73(2 Suppl):365S-373S. PubMed Abstract | Publisher Full Text
42. Shoesmith JG, Worsley BW: Anaerobes and exposure to oxygen.SocApplBacteriolSympSer 1984, 127-146. PubMed Abstract
43. de Man JC, Rogosa M, Sharp ME: A medium for the cultivation of Lactobacilli.J ApplBacteriol 1960, 23:130-135.
44. Vollenweider S, Grassi G, Konig I, Puhan Z: Purification and structural characterization of 3-hydroxypropionaldehyde and its derivatives.J Agric Food Chem 2003, 51(11):3287-3293. PubMed Abstract | Publisher Full Text
45. El-Ziney MG, Arneborg N, Uyttendaele M, Debevere J, Jakobsen M: Characterization of growth and metabolite production of Lactobacillus reuteri during glucose/glycerol cofermentation in batch and continuous cultures.Biotechnology Letters 1998, 20(10):913-916. Publisher Full Text
46. Mota-Meira M, LaPointe G, Lacroix C, Lavoie MC: MICs of mutacin B-Ny266, nisin A, vancomycin, and oxacillin against bacterial pathogens.Antimicrob Agents Chemother 2000, 44(1):24-29. PubMed Abstract | Publisher Full Text | PubMed Central Full Text
47. Lennette EH, Balows A: Manual of clinical biology. Third Edition edition. Edited by Lennette EH, Balows A, Hausler WJ, Truant JP. Washington, DC , Americansocietyformicrobiology; 1980.
48. Ellman GL: Tissue sulfhydryl groups.Arch BiochemBiophys 1959, 82:70-77. PubMed Abstract | Publisher Full Text
49. Doleyres Y, Fliss I, Lacroix C: Increased stress tolerance of Bifidobacteriuмлongum and Lactococcuslactis produced during continuous смешивали-strain iммольobilized-cell fermentation.J ApplMicrobiol 2004, 97(3):527-539. PubMed Abstract | Publisher Full Text