Лабораторная диагностика ротавирусной инфекции

Ротавирусные гастроэнтериты

В высокоразвитых странах более 60% острых гастроэнтеритов вызывают вирусы из семейства Reoviridae. Среди них доминируют ротавирусы. Род Rotavirus включает ротавирусы человека и вирусы, вызывающие диареи у животных. Последние для человека непатогенные. Ротавирусы человека вызывают, в основном, гастроэнтериты у детей до трех лет и пожилых людей. Возбудитель передается фекально-оральным способом при бытовых контактах. Высокая устойчивость вирусов во внешней среде способствует развитию вспышек гастроэнтеритов особенно в зимний период (до 90%). За белковыми антигенами ротавирусы разделяют на 4 серовариантив.

Материал для лабораторной диагностики

Материалом для лабораторной диагностики служат стул и кровь. Пробы кала принимают в первые часы и дни болезни в стерильные пенициллиновые флаконы и направляют в вирусологической лаборатории в контейнерах со льдом. Готовят 10-20% суспензию в растворе Хэнкса, центрифугируют 30 мин при 3000 об / мин. Центрифугат переносят в стерильный флакон, добавляют фреон 113 или 1000 ЕД / мл пенициллина и 500 ЕД / мл стрептомицина, помещают в холодильник на 10-12 часов. Кровь для серологических реакций принимают в первые 2-3 дня болезни и через 12-14 дней. Лабораторная диагностика вирусных диарей основывается на быстром обнаружении вирусов в кале с помощью электронной и иммунной электронной микроскопии, реакции непрямой гемагглютинации с антительным эритроцитарным вирусных диагностикумом. Используют также иммуноферментный анализ в твердофазном варианте реакцию коаглютинации, метод клонированных РНК-зондов и полимеразной цепной реакции. В первые дни болезни содержание ротавирусов в копроматериалах достигает 106-108 в 1 г, поэтому их обнаружение при прямой электронной микроскопии возможно без дополнительной концентрации. Каплю исследуемого материала наносят на специальные пленки из нитроцеллюлозы и микроскопируют при увеличении 50000. Метод чувствительный и надежный, позволяет быстро обнаружить вирус и исследовать его морфологию. При обнаружении 5-6 вирионов практически в каждом поле зрения можно достоверно подтвердить диагноз ротавирусного гастроэнтерита. Еще большее диагностическое значение имеет метод имуноелектроннои микроскопии. Принцип ее заключается в том, что иммунную противовирусную сыворотку добавляют к освещенной низкоскоростным центрифугированием суспензии фекалий, выдерживают 60 мин при комнатной температуре и еще 12 ч при 4 ° С, затем центрифугируют при 15000 об / мин для осаждения вирусных частиц и иммунных комплексов. Осадок ресуспендируют в 2-3 каплях дистиллированной воды, контрастируют в фосфорно-вольфрамовой кислоты и исследуют под электронным микроскопом. В препаратах обнаруживают характерные скопления ротавирусов. Высокая эффективность метода практически не зависит от исходной концентрации вирусов в исследуемых пробах.

Вирусологические исследования

Вирусологические исследования с целью выделения ротавирусов в культурах клеток или на лабораторных животных в рутинных вирусологических лабораториях не проводится. Наиболее широко в диагностике вирусных гастроэнтеритов используют иммуноферментный анализ. Принцип его заключается в том; что лунки полистироловых планшет сначала сенсибилизують антителами против ротавирусов, а затем добавляют в них освещенную суспензию фекалий, инкубируют 1 ч в термостате. Образован в лунках комплекс антиген-антитело после трехкратного промывания фосфатным буфером проявляют внесением антиглобулиновои сыворотки, конъюгированных с ферментом. После инкубации в термостате добавляют хромогенных субстратов до появления окрашенного продукта реакции. Учет результатов проводят с помощью иммуноферментного анализатора. В небольших лабораториях достаточно часто проводят реакцию обратной непрямой гемагглютинации с использованием антительного ротавирусного эритроцитарного диагностикума. Она проста по методике постановки, хотя и менее чувствительна по сравнению с реакцией ензиммичених антител. В практику лабораторной диагностики вирусных инфекций вводят также тест коаглютинации для индикации ротавирусного антигена в кале больных. На предметное стекло наносят каплю взвеси стафилококков (штамм Cowan 1), сенсибилизированных ротавирусной сывороткой, и добавляют каплю освещенного центрифугированием копроматериалу. При наличии ротавирусов через 30-60 с возникает агглютинация нагруженных антителами стафилококков. Очень чувствительным способом быстрой диагностики вирусных гастроэнтеритов является метод выявления вирусоспецифические РНК с помощью молекулярной гибридизации. Он основан на гибридизации меченых РНК-зондов, фиксированных на нитроцеллюлозные фильтрах. Мечение осуществляют биотином или ферментом, что значительно упрощает и удешевляет метод по сравнению с радиоизотопными метками.

Анализ ротавирусной РНК

Анализ ротавирусной РНК, несмотря на его дороговизну, все шире внедряется в практику, особенно после разработки метода полимеразной цепной реакции. Последняя является чувствительным и специфическим методом диагностики, который, безусловно, является диагностическим тестом нового поколения, так называемым "золотым стандартом". Однако постановка этой реакции все еще требует высокой квалификации исследователя, дорогих реактивов и сложной аппаратуры.

Серологическая диагностика

Серологическая диагностика направлена на выявление специфических антител в парных сыворотках, взятых с двухнедельным интервалом. Для этой цели используют различные нейтрализационных или преципитацийни тесты и непрямую реакцию иммунофлюоресценции. Но в последнее время широко применяют иммуноферментный анализ. Раньше для серодиагностики широко ставили РСК с использованием в качестве антигена предварительно отобранные фекалии больных гастроэнтерит или ротавирусы телят. Но по своей чувствительностью и специфичностью она значительно уступает метода иммуноферментного анализа. Для выявления специфических антител к ротавирусов ставят также реакцию торможения непрямой гемагглютинации с парными сыворотками. Гастроэнтериты у детей могут также вызвать калицивирусы, астровирусы и вирусы Норволк. Все они выделяются с испражнениями в первые 2-3 дня заболевания, не размножаются в культурах клеток или слабо репродуцируются без цитопатического действия. Для лабораторной диагностики гастроенетеритив, вызванных данными вирусами, используют, в основном, метод иммунной электронной микроскопии. Других методов диагностики, доступных для вирусологических лабораторий, пока нет.